免疫组化中的染色剂

免疫组化在临床及病理诊断中已广泛应用，对疾病的判定、鉴别诊断及判定疾病的预后及临床医师对疾病的治疗具有重要的指导意义。其在蛋白抗原的细胞准确定位上是其他蛋白检测方法无法相比的。 免疫组化的基本操作和异常结果分析我们在之前的文章中已经和大家分享过了，今天我们主要来说一说免疫组化中经常用到的“底物和染色剂”！

对于辣根过氧化物酶来说，我们常规用DAB（二氨基联苯胺)或AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）染色。

DAB（二氨基联苯胺)通常作为过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物。细胞颗粒中的过氧化物酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺，形成棕黄色沉淀而定位于过氧化物酶活性的部位。反应产物不溶于水、二甲苯和醇，因而适用于多数复染剂和封片剂。

在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。可配合DAB染色使用的复染方法包括亚甲基蓝、甲基绿和苏木精。

另外因为其电子密度高，可用于电子显微镜观察。还可以通过用硫酸镍或氯化钻进行后处理，可以产生更好的对比度。

左：人乳腺纤维瘤组织的免疫组织化学染色anti-CD206 (Biorbyt，dilution at 1:100)

右：小鼠皮肤组织的IHC-P染色anti-CD45 (Biorbyt，dilution at 1:100)

但是DAB属于联苯胺类化合物(BZC)中的一种，现已被证实具有免疫毒性、生殖毒性、遗传毒性、致癌性等毒性，尤其对泌尿系统可致膀胱癌，被国际癌症研究中心(IARC)确认为致癌物。如果用DAB，液体配制应在通风橱内进行，操作者应戴口罩和手套。一般认为工作液危害较小；但粉剂危害较大。除使用过程中要特别注意安全防护外，使用后的废液存放和去毒性处理也应引起高度重视。

在我国由于实验室比较分散，单个实验室产生的废液量较少，很少受到实验使用人员和有关部门的重视，大多实验室都是未经任何处理直接排入下水道，这种情况下日积月累、积少成多也是非常可怕的。为保护环境，减少污染，每个使用DAB的实验室应当把DAB废液的去毒性处理制定成一项实验室守则，严格执行。

DAB的毒性处理原则是DAB分子完全被破坏且反应副产物和终产物也必须不具备诱变性。一直被沿用至今的是“硫酸-高锰酸钾法”，DAB被处理后不但分子被完全破坏，反应终产物也无诱变性，处理后可以按普通实验室废液处置。

具体处理步骤如下：

• 硫酸-高锰酸钾水溶液的配制

  a:0.2 M高锰酸钾水溶液:高锰酸钾31.6 g，蒸馏水1000 ml; b:2.0M的硫酸水溶液:浓硫酸112 ml,蒸馏水1000 ml。

• 收集废弃DAB液

  包括显色后洗片、洗器皿的自来水和剩余的DAB显色液，稀释后DAB的浓度不超过0.9 mg/ml。

• 去毒性反应

  废弃DAB液每10 ml加入上述5 mla液和5 mlb液，混合后静置不低于10 h或过夜，此时DAB的致癌性基本解除。

• 脱色

  加入抗坏血酸或草酸脱色，边加边搅拌至废液退至无色。

• 中和

  加入碳酸氢钠中和pH值6至8，经PH试纸检测。

• 处理

  有废液回收条件的按普通实验室废液回收，没有回收条件的可以混合大量自来水倾入下水道冲走。

与硫酸-高锰酸钾法相比，被公认更有效的处理方式是焚烧废弃物的处置方法，DAB废弃物加入燃料被焚烧后苯环完全被破坏，排出的有毒的氮氧化物可以通过洗涤器除去。但焚烧法需要有专业的回收和存放，较适合集中DAB的毒性处理，而硫酸-高锰酸钾法较适合实验室使用。

AEC（3-氨基-9-乙基咔唑），虽然溶于乙醇，因为比DAB致癌危险性低，目前也已经应用广泛。

AEC产生鲜红色，与用苏木精复染可形成鲜明的对比。但注意应用不含乙醇的苏木精，如Mayer，而不用Harris，以避免将溶于乙醇的AEC有色反应产物溶解。

当抗原- 抗体- 酶浓度高时，AEC 可能产生棕黄色产物(AEC有两个反应位点，当其中一个被转变时，变成红色；当两个都和过氧化物酶反应时，产生棕绿色产物)。pH值为4.8的乙酸缓冲液能减轻这一反应。切片应用水性介质(如80%甘油)封片。水性封片剂含有少量有机溶剂，可使染色慢慢溶解或消失。注意不能用乙醇脱水。甘油封片可用指甲油将盖玻片边缘密封以长期保存。

其他染色剂还有a-萘酚派若宁(粉色)、4-氯1-茶酚(蓝色)和Hanker-Yates 以及大量广谱染色剂 (见下表1)。反应底物也适用于碱性磷酸酶。有些底物在酶位点上持续反应，产生颗粒状有色物质，从而使碱性磷酸酶系统反应更敏感。但如果反应过度，这些颗粒可能使组织形态模糊。

参考文献

1.陈庆，康维钧，联苯胺类化合物的毒性研究进展.河北医科大学学报，2007，28(6):460.

2.王晋芬，王跃华.DAB废物处理程序中华病理学杂志，2005，34(12):775.

3.David J.Dabbs．诊断免疫组织化学[M]，第二版，周庚寅，翟启辉，张庆慧，北京大学医学出版社，2008.7：19-20。